2019.07月Advanced Science（IF=15.804）新鲜出炉的一篇天津医科大学、首都医科大学天坛医院研究团队合作的文章，该研究利用CRISPR/CAS9全基因KO文库发现EGFR突变型胶质瘤患者通过EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB/ E2F6 途径对替莫唑胺（TMZ）产生抗性，该敲除文库包含123,411个sgRNA靶点，可靶向敲除19,050个编码基因及1864个miRNA。

       胶质瘤是一种侵袭性很高的脑内肿瘤，而且在经过手术后化疗或放疗后复发率高。EGFR是胶质瘤发生的一个重要驱动基因，高达30 %的GBM患者可检测到 EGFR vIII突变体。替莫唑胺（TMZ）是口服烷化剂，一线化疗药，作为新诊断的GBM的当前标准治疗药物。 TMZ可导致细胞周期停滞在G2 / M期，并介导DNA损伤，并随后介导细胞凋亡。虽然口服TMZ给药有助于GBM患者生存周期整体增加，但癌细胞最终会对TMZ产生耐药性。那么对于 EGFR vIII胶质瘤患者对TMZ耐药的具体机制如何呢？

       作者将KO 文库质粒扩增提取后分别感染87-EGFRvIII 和 U87 wt细胞，再分别用DMSO和药物TMZ处理细胞，处理7d和14d的时候收集细胞，PCR产物扩增回收后进行sgRNA测序，检测各sgRNA丰度变化。

CRISPR KO文库筛选EGFRvIII突变型胶质母细胞TMZ抗性基因流程

       测序结果分析显示，TMZ处理后U87-EGFRvIII 和 U87 wt进行比较，发现有981个基因与TMZ耐受相关基因，和929个基因与TMZ敏感相关基因（c）。对这4组基因中的共同的191个显著差异基因进行KEGG分析，发现该群差异基因主要富集在剪接体、核糖体和细胞周期通路上。

       通过IPA分析U87-EGFRvIII 和 U87 wt细胞组间的差异基因，富集的通路为CD28通路、NF-κB通路，NFAT通路等。前期已有研究表明（P.H. Huang，2009）EGFRvIII优先激活磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）-AKT，随后激活非经典NF-κB途径。作者提出假说：TMZ耐药是否通过EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB/ E2F6 途径？

       在补充数据中作者对U87wt 和U87-EGFRvIII细胞进行了RNA-seq转录组表达检测，发现有19个基因在U87-EGFRvIII细胞中显著高表达。同时，又对U87wt 和U87-EGFRvIII细胞分别给与DMSO和TMZ处理，对细胞样本进行RNA-seq检测。结合之前的KO 文库筛选数据，E2F6这个基因是唯一一个既在文库筛选时，敲除后能增强TMZ对细胞的杀伤，同时又在U87-EGFRvIII细胞中高表达，且会被TMZ诱导高表达的基因。因此选择E2F6进行后续研究。

      接着进行了E2F6临床相关性的研究，结合TCGA的数据以及Rembrant数据显示E2F6在胶质瘤中的表达与胶质瘤分级显著相关，且在胶质瘤经典亚型中的表达显著高于PN型和MES型。并用临床样本进行了免疫组化验证。利用TCGA数据库分析与E2F6表达相关的基因，发现这些基因显著富集到细胞周期和DNA修复通路上。

      下面作者通过体外细胞实验对E2F6进行功能研究，过表达EGFRvIII，再给予TMZ处理，发现E2F6的表达显著增加。而在EGFRvIII过表达和对照组细胞中，去干扰和过表达E2F6，通过CCK8及平板克隆形成实验说明E2F6表达会和细胞对TMZ耐受减弱和增强有关。说明E2F6是产生TMZ抗性的关键基因。

       进一步实验作者证明了EGFRvIII和TMZ可激活Akt通路以及NF-κB通路，并激活调控E2F6表达。下图ab：NF-κB影响E2F6蛋白和基因表达；c：TMZ影响p-NF-κB蛋白水平，影响NF-κ通路的转录激活，d：TMZ影响p-AKT蛋白水平，影响AKT信号。

       ChIP-PCR检测：EGFRvIII增加E2F6启动子中H3K4me3和p-NF-κB的富集（f）；AKT抑制剂MK-2206处理降低了H3K4me3和p-NF-κB与E2F6启动子的相互作用（g） ；用RelA / p65表达质粒和报告载体共转染GBM细胞，荧光素酶实验显示NF-κB可直接激活E2F6表达。

       另外，作者通过体内实验进一步证明：E2F6是TMZ抗性的因素。作者在U87细胞中过表达E2F6，在U87 EGFRvIII细胞中干扰E2F6，与分别的对照组细胞进行裸鼠颅内注射，进行原位瘤模型构建，并在1周后开始给与TMZ，TMZ治疗2周后进行活体成像观察。结果显示，U87细胞进行E2F6过表达后对TMZ产生耐受，U87 EGFRvIII细胞对E2F6 敲低后TMZ治疗敏感。作者接着取肿瘤组织进行免疫组化检测NF-κB, p-NF-κB, and E2F6 蛋白水平。研究表明，对于EGFR vIII胶质瘤患者抑制E2F6表达可能是解决TMZ耐受的治疗策略。

      下面作者进一步运用E2F6上游通路的NF-κB 抑制剂 (JSH-23) ，与TMZ进行联合，检测联合用药对对胶质瘤的治疗效果。活体成像结果显示，联合用药组的肿瘤抑制作用最为明显，同时对小鼠的体重影响最小，生存期也最长。说明抑制NF-κB/E2F6轴可增加GBM 对 TMZ的敏感性。

       最后，作者又进行了临床样本的验证，采用中国脑胶质瘤基因组图谱CGGA数据进行Kaplan-Meier分析显示E2F6表达水平与无进展生存期(PFS)呈负相关，单变量和多变量Cox分析显示E2F6是CGGA GBM队列中的独立预后标志物。对来自天坛医院的53例接受标准治疗的原发GBM肿瘤进行分析，也发现E2F6的表达水平与PFS呈负相关。

       最终，本研究通过CRISPR全基因KO文库筛选发现EGFR vIII型胶质瘤与TMZ耐受高度相关的基因E2F6，并通过体内外功能实验、机制研究证明TMZ耐药通过EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB/ E2F6途径，抑制E2F6表达可能是解决EGFRvIII型胶质瘤对TMZ耐受的潜在治疗策略。